Filtrace TFF s tangenciálním průtokem v kombinaci s ultracentrifugací pro účinnou přípravu malých extracelulárních vezikul

Malé extracelulární vezikuly (sEV) jsou nanočástice secernované buňkami, které obsahují nukleové kyseliny, proteiny, malé molekuly a další složky a hrají důležitou roli v mezibuněčné komunikaci. Malé extracelulární váčky typu exosom- sdílejí velké podobnosti se svými mateřskými buňkami. Ve srovnání s umělými nanočásticemi vykazují nižší rychlost imunitní clearance a nižší cytotoxicitu, což z nich dělá slibné kandidáty jako novéin vivo nosiče pro podávání léčiv. Téměř všechny typy buněk mohou tyto vezikuly vylučovat a výzkum jejich aplikace jako nosičů léků se postupně přesouvá z laboratoře ke klinickým aplikacím. Však,velký{0}}výroba zůstává hlavním úzkým hrdlem.

 

Současné metody izolace extracelulárních vezikul

Současné metody izolace extracelulárních vezikul zahrnujíultracentrifugace, centrifugace s hustotním gradientem, velikostní-vylučovací chromatografie (SEC) a srážení polyethylenglykolem (PEG).

Precipitace PEG nabízí vysoký výtěžek a jednoduchou operaci, ale je spojena s významnou kontaminací nežádoucími proteiny. Centrifugace s hustotním gradientem a velikostní-vylučovací chromatografie mohou poskytnout vysoce-čisté produkty, ale jejich účinnost je relativně nízká a procesy jsou časově-náročné. Ultracentrifugace je široce používána, ale její objem zpracování je omezen kapacitou odstředivky, což ztěžuje její zvětšování.

 

Aplikace tangenciální průtokové filtrace pro separaci sEV

Tangenciální průtoková filtrace (TFF) již byla aplikována na separaci nanočástic, jako jsou lipozomy a lentivirové vektory. V TFF proudí nástřik tangenciálně přes povrch membrány, což pomáhá snižovat zanášení membrány a usnadňuje proces zvětšování měřítka.

Protože malé extracelulární vezikuly se obecně pohybují od30-200 nmv průměru, a0,45 μm membránová kazetalze vybrat v systému TFF k odstranění větších proteinů a vezikul, zatímco a300 kDa membránová kazetalze použít k odstranění nízkomolekulárních proteinů{0}}a koncentrovat malé extracelulární vezikuly přítomné v kultivačním médiu.

 

Charakterizace suroviny po separaci TFF

Analýza sledování nanočástic (NTA) ukázala, že průměry částic byly distribuovány hlavně v rozmezí0–250 nm.

 

 

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) však odhalila velké množství kontaminujícího proteinu, zatímco nebyly pozorovány žádné extracelulární vezikuly. Tyto výsledky naznačují, že k dalšímu čištění extracelulárních vezikul byl nutný další purifikační krok.

 

Charakterizace TFF koncentrátu po 100 kDa ultrafiltraci

TFF koncentrát byl dále zpracován za použití a100 kDa ultrafiltrační trubice.

NTA ukázala, že průměry částic v koncentrátech získaných po jednom a dvou kolech ultrafiltrace zůstaly převážně v rozmezí0–250 nm. Provedení ultrafiltrace dvakrát však vedlo k významnému snížení počtu získaných částic.

Analýza TEM ukázala, že nebyly pozorovány žádné vezikulární-struktury v koncentrátech pro jedno-ani{2}}násobnou ultrafiltraci, přičemž zůstalo značné množství kontaminujícího proteinu.

Proto,Ultrafiltrace 100 kDa nemohla být účinně použita k čištění kultivačního média po koncentraci TFF.

 

 

Charakterizace TFF koncentrátu purifikovaného ultracentrifugací

NTA ukázala, že průměry částic vyčištěných produktů byly distribuovány hlavně v rozmezí0–250 nm.

Důležité je, že TEM jasně odhalil-vezikulární struktury v různých zorných polích. Tyto výsledky ukázaly, že po zkoncentrování kultivačního média pomocí TFF,ultracentrifugace může být následně použita pro další separaci a čištění extracelulárních vezikul.

 

 

Charakterizace sEV izolovaných z média upraveného mezenchymálními kmenovými buňkami pomocí TFF v kombinaci s ultracentrifugací

NTA ukázala, že průměry částic vyčištěných produktů byly distribuovány hlavně v rozmezí0–250 nm.

Struktury podobné vezikulám byly pozorovány pomocí TEM. Analýza Western blot prokázala pozitivní expresi proteinů asociovaných s extracelulárními vezikuly-CD9, CD63 a ALIXv purifikovaných extracelulárních vezikulách.

Tyto výsledky potvrdily, že purifikované malé extracelulární vezikuly obsahovaly exozomy, což naznačuje, že tato metoda může být také použita proizolace a extrakce exosomů.

 

 

Závěr: TFF v kombinaci s ultracentrifugací pro vysoce{0}}kvalitní přípravu sEV

Studie to prokázalaSamotná koncentrace TFFvýsledkem byl produkt obsahující značné množství kontaminujících proteinů a byl proto nedostatečný pro získání kvalifikovaných extracelulárních vezikul.

Stejně tak pomocí a100 kDa ultrafiltrační zkumavka pro sekundární čištěníneposkytly účinně neporušené struktury vezikul.

Kombinací koncentrace TFF s následným ultracentrifugačním čištěním lze získat výhody obou technikvysoce kvalitní-produkty z malých extracelulárních váčků.

Ve srovnání s konvenční ultracentrifugací samotnou může kombinovaný proces efektivněsnížit celkovou dobu zpracování a zlepšit účinnost separace.

V tomto pracovním postupuTFF umožňuje rychlé obohacení-velkoobjemových vzorků, řešící omezení konvenční ultracentrifugace při zpracování velkých objemů vzorků. Ultracentrifugace pak provádí hloubkové čištění, aby se odstranily ko-koncentrované proteinové nečistoty a zároveň pomáhá zachovat čistotu a integritu vezikul.

Kromě toho proces nevyžaduje přidáníexogenní chemická srážecí činidlapomáhá zachovat biologickou aktivitu vezikul v co největší míře.

Z hlediska průmyslového překladu je tento proces významnýzvýšit-potenciála může pomoci řešit problémy spojené s-rozsáhlou výrobou extracelulárních váčků prododávání léků, regenerativní medicína a související vývoj produktů. Poskytuje také solidní experimentální základ pro následnou optimalizaci procesů a pilotní-výrobu.

 

Odkaz

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha a kol.Zavedení metody pro separaci malých extracelulárních vezikul pomocí tangenciální průtokové filtrace v kombinaci s ultracentrifugací. Chinese Journal of Biologicals, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.